原理
用于親和層析的凝集素應根據(jù)它們結(jié)合的特異性和緊密度加以選擇。例如,刀豆素 A(Con A)與糖蛋白含有的葡萄糖或甘露糖結(jié)合,而麥芽凝集素只與具 N-乙酰葡糖胺的蛋白質(zhì)結(jié)合。胞膜糖蛋白常與麥芽凝集素結(jié)合,而可溶性糖蛋白卻通常用 Con A 或扁豆凝集素親和柱純化。由于在許多情況下被純化的糖蛋白的結(jié)構(gòu)和特性不清楚,所以篩選一些凝集素與目的蛋白的結(jié)合狀況常常是有用和必要的。用于此目的的凝集素試劑盒也可購得。
凝集素親和層析相對易于操作??捎迷S多方法將凝集素固相化到介質(zhì)。溴化氰偶聯(lián)是普遍采用的方法。每 ml 介質(zhì)材料能偶聯(lián)凝集素。偶聯(lián)時含有適宜的二價離子(0.1 mmol/L)和保護性糖類(5%,w/v)是關鍵。保護性糖類在偶聯(lián)過程中使結(jié)合部位不易接近而受到保護。許多凝集素親和柱也可從市場購得。
以下步驟以介紹刀豆素 A 親和柱純化蛋白質(zhì)為例,其他凝集素親和柱的純化步驟基本相似,只要換成適宜的洗脫用糖。相對長而細的層析柱有更好的分辨率,短而粗的柱子在小體積洗脫時具有更快的流速。小的試驗柱(例如裝填在巴斯德吸管內(nèi)的)或在小離心管內(nèi)進行的層析試驗可用于估算柱的結(jié)合容量。
材料與儀器
糖蛋白樣品液
甲基-α-D-甘露糖 NaCl NaN3 Tris-HCl NaCl Mncl2 CaCl2 辛糖苷
層析柱
步驟
1. 制備刀豆素 A 親和柱;
2. 用 10 倍柱體積的層析緩沖液(20 mmol/L ,pH 8.0 Tris-HCl,0.15 mol/L NaCl,1 mmol/L MnCl2,1 mmol/L CaCl2,30 mmol/L 辛糖苷)平衡裝好的親和柱;
3. 糖蛋白樣品液對層析緩沖液透析或用該緩沖液 1:1稀釋,然后離心或過濾除去沉淀;
4. 將調(diào)整好的糖蛋白樣品液上樣到親和柱;
5. 用層析緩沖液洗柱至 A280 值回到基線;
6. 用 5 倍柱體積含10 mmol/L 甲基-α-D-甘露糖的層析緩沖液洗脫;
7. 繼續(xù)分別用 5 倍柱體積含 20、50、100、250和 500 mmol/L 甲基-α-D-甘露糖的層析緩沖液洗脫;
8. 檢測目的蛋白組分。匯集的目的蛋白組分透析除去糖;
9. 用含 1 mol/L NaCl 的層析緩沖液洗柱,以獲得再生;
注意事項
一些凝集素在它們的結(jié)構(gòu)整合中需要某些二價離子。因為凝集素親和層析常常涉及膜蛋白質(zhì),故經(jīng)常需要去垢劑以保持這些蛋白質(zhì)的可溶性。雖然凝集素對非離子型去垢劑相當寬容,但是離子型去垢劑減少它們的特異結(jié)合。
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